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木薯醇腈酶(HNL)cDNA在大肠杆菌中高效表达的初步研究
将编码木薯醇腈酶(HNL)cDNA克隆到原核表达载体pBV220,构建了大肠杆菌(Escherichia coli)中表达质粒 pBV220-HNL.含重组质粒pBV220-HNL的.大肠杆菌DH5α菌株经温度诱导后,其表达产物以包涵体形式存在.SDS-PAGE分析及酶活测定的结果表明木薯HNL cDNA在大肠杆菌中成功表达.
作 者：王丹 万洁 李维 高勇 WANG Dan WAN Jie LI Wei GAO Yong 作者单位：王丹,WANG Dan(成都医学院,医学检验系,四川,成都,610083)万洁,李维,高勇,WAN Jie,LI Wei,GAO Yong(四川师范大学,生命科学学院,四川,成都,610066)
刊 名：四川师范大学学报（自然科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF SICHUAN NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE) 年，卷(期)： 29(3) 分类号：Q786 关键词：醇腈酶cDNA 温度诱导 包涵体人工合成草鱼生长激素cDNA在大肠杆菌中的表达
经密码子优化的人工合成草鱼生长激素cDNA与表达载体pET-28a(+)重组，构建重组表达质粒pET-GH。转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性克隆，IPTG诱导表达。12.5％的SDS-PAGE分析显示，大肠杆菌表达产物中含有与草鱼生长激素分子量一致的`新增蛋白带，激光密度扫描，其产量约占菌体总蛋白的40％。金属离子螯合层析柱亲和纯化，获得电泳纯的重组蛋白。Western-blotting和酶联免疫吸附受体法检测证实：重组蛋白与抗草鱼生长激素的多克隆抗体发生特异性结合；复性后的重组蛋白有与天然草鱼生长激素一致的生物学活性。
作 者：王伟 汪亚平朱作言 WANG Wei WANG Ya-Ping ZHU Zuo-Yan 作者单位：中国科学院水生生物研究所, 刊 名：遗传学报 ISTIC SCI PKU英文刊名：ACTA CENETICA SINICA 年，卷(期)： 28(4) 分类号：Q95 关键词：草鱼生长激素 原核表达 纯化 酶联免疫吸附受体检测大肠杆菌中高效表达rhBMP-4的探讨及初步活性测定
目的:在大肠杆菌中表达具有生物活性的rhBMP-BMP-4.方法:在不改变氨基酸序列的前提下,以全基因合成的'方式对人BMP-4成熟肽基因全长进行定点突变,将之重组入pET-3c表达载体并转化至大肠杆菌BL21(DE)plysS.IPTG诱导和包涵体复性后,利用C2C12细胞横向成骨细胞分化实验以及小鼠肌袋异位骨形成实验检测其活性.结果:获得0.348kb的BMP-4 DNA序列,表达的目的蛋白主要以包涵体的形式存在.经纯化及复性后,体内与体外的活性检测表明rhBMP-4有良好的诱骨生成活性.结论:该方案能够实现rhBMP-4在大肠杆菌中的高效表达.
作 者：高思红 汪炬 董群伟 刘侃 刘雪婷 洪岸 谢秋玲 孙奋勇 GAO Si-hong WANG Ju DONG Que-wei LIU Kan LIU Xue-ting HONG An XIE Qiu-ling SUN Fen-yong 作者单位：高思红,汪炬,刘侃,刘雪婷,洪岸,谢秋玲,孙奋勇,GAO Si-hong,WANG Ju,LIU Kan,LIU Xue-ting,HONG An,XIE Qiu-ling,SUN Fen-yong(暨南大学生物工程研究所,广州,510632)董群伟,DONG Que-wei(广东药学院附属第一医院骨科,广州,510632)
刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 26(3) 分类号：Q81 关键词：rhBMP-4 定点突变 包涵 体活性几丁质酶基因表达载体pET-chiB的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达
几丁质酶在降解几丁质的过程中起着重要作用,目前人们已从不同微生物体中分离并克隆出了多种几丁质酶基因.实验以pET-22b(+)为载体,利用从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)克隆出的'chiB基因,构建出原核生物表达载体pET-chiB.通过表达载体pET-chiB的诱导表达.实验结果显示该基因表达的蛋白为可溶性蛋白,其分子量约为52 kD.利用不同参数包括时间、IPTG浓度和温度诱导表达载体pET-chiB表达并对表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示其诱导表达的最佳参数分别为4 h,0.5 mmol/L和25℃.这些结果为几丁质酶基因的进一步研究和几丁质酶工程菌生产奠定了良好的工作基础.
作 者：叶辉 冯春 程郢 朱苏文 程备久 YE Hui FENG Chun CHENG Ying ZHU Su-wen CHENG Bei-jiu 作者单位：叶辉,YE Hui(安徽农业大学生物技术中心,安徽,合肥,230036;安徽农业大学生命科学学院,安徽,合肥,230036)冯春,FENG Chun(安徽农业大学农业园及试验总场管理中心,安徽,合肥,230036)
程郢,朱苏文,程备久,CHENG Ying,ZHU Su-wen,CHENG Bei-jiu(安徽农业大学生命科学学院,安徽,合肥,230036)
刊 名：激光生物学报 ISTIC英文刊名：ACTA LASER BIOLOGY SINICA 年，卷(期)： 17(3) 分类号：Q786 关键词：几丁质酶基因 pET-chiB 构建 表达 IPTG诱导 chitinase gene pET-chiB construction expression IPTG inducing蛇毒纤溶酶Alfimeprase在大肠杆菌中的可溶表达和纯化
Alfimeprase是Fibrolase的.突变体,是一种蛇毒纤溶酶,有纤溶活性而无出血性.根据Alfimeprase的氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性,利用PCR的方法合成Alfimeprase DNA序列,分别融合在NusA和MBP的C端,与分子伴侣FkpA在大肠杆菌Origami B(DE3)中共表达,融合蛋白NusA/Alfimeprase以部分可溶的形式存在,可溶部分占上清总蛋白的25%左右,通过镍柱亲合层析纯化和肠激酶切割得到具有纤溶活性的重组蛋白Alfimeprase.首次报道在大肠杆菌中可溶表达Alfimeprase,为以后深入研究其功能及应用奠定了基础.
作 者：张守涛 周雁胜 赖学华 包星峰 郭蔼光 ZHANG Shou-tao ZHOU Yan-sheng LAI Xue-hua BAO Xing-feng GUO Ai-guang 作者单位：西北农林科技大学,生命科学学院,杨凌,712100 刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 26(3) 分类号：Q81 关键词：蛇毒纤溶酶 分子伴侣 可溶性表达 纯化酶联免疫测定技术在研究氟虫腈降解中的应用
利用单克隆抗体间接竞争ELISA技术检测氟虫腈在青菜和土壤中的降解规律.其在青菜中的`降解动态符合一级降解动力学方程C＝0.192 7e-0.066 6t,降解半衰期为10.4 d, r＝-0.978 7;在土壤中的降解符合一级降解动力学方程C＝0.099 0e-0.045 9t,半衰期为15.1 d, r=-0.982 6.在室内从紫外线、臭氧、pH值、原子辐照4个方面对氟虫腈消解状况进行了分析,发现紫外线照射 25 h 时,氟虫腈降解率最高可达到90%;通入臭氧 60 min 时,氟虫腈降解率最高可达48.5%;溶液pH为12时,氟虫腈在 48 h 时降解率高达88.0%;而辐照处理对氟虫腈的降解效果不明显.
作 者：颜春荣 刘贤进 余向阳 张存政 王冬兰 李进 YAN Chun-rong LIU Xian-Jin YU Xiang-yang ZHANG Cun-zheng Wang Dong-lan LI Jin 作者单位：颜春荣,YAN Chun-rong(江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究中心,江苏,南京,210014;江苏省产品质量监督检验中心所,江苏,南京,210029)刘贤进,余向阳,张存政,王冬兰,李进,LIU Xian-Jin,YU Xiang-yang,ZHANG Cun-zheng,Wang Dong-lan,LI Jin(江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究中心,江苏,南京,210014)
刊 名：江苏农业学报 ISTIC PKU英文刊名：JIANGSU JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES 年，卷(期)： 21(2) 分类号：X592 关键词：氟虫腈 降解 酶联免疫测定技术重组酶Cre基因在大肠杆菌中的高效表达及其一步纯化和活性检测
为了实现DNA重组酶Cre在体外的应用,以pET-30a高效表达载体为基础构建了pTE30-Cre质粒.将此质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导的Cre基因的`高效表达.对表达出的Cre重组酶蛋白进行镍离子鳌合法一步纯化,并以带有两个同向loxP位点的质粒为底物,对纯化出的Cre酶进行活性检测.该实验为Cre酶的体外应用奠定了基础.
作 者：王文棋 盖颖 陆海 蒋湘宁 WANG Wen-qi GAI Ying LU Hai JIANG Xiang-ning 作者单位：北京林业大学生物科学与技术学院 刊 名：北京林业大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY 年，卷(期)： 28(3) 分类号：Q559+.1 关键词：DNA重组酶Cre pET30-Cre高效表达 一步纯化 Cre酶活性检测八肋游仆虫γ微管蛋白cDNA序列及其在大肠杆菌中的表达
提取八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)的mRNA,采用RT-PCR技术对其γ微管蛋白基因的'cDNA序列进行了分析.结果表明八肋游仆虫的微管蛋白编码基因至少使用4个转录起始位点, 分别位于起始密码子前的32、29、24和20bp处;该基因同时也有至少4多聚腺苷酸加尾位点,分别位于终止密码子后的21、23、29和32 bp处.由于多个转录起始位点和多聚腺苷酸加尾位点的存在,对应的mRNA长度在1427～1450 核苷酸之间.此外,本研究对该基因中编码半胱氨酸的TGA密码子进行定点突变,然后在大肠杆菌中进行异体表达, SDS-PAGE分析表明表达产物为92kDa的γ微管蛋白融合蛋白.
作 者：谭明 梁爱华 Tan Ming Liang Aihua 作者单位：谭明,Tan Ming(中山大学生物系,广州,510275)梁爱华,Liang Aihua(山西大学生物工程室,太原,030006)
刊 名：高技术通讯 ISTIC EI PKU英文刊名：HIGH TECHNOLOGY LETTERS 年，卷(期)： 10(4) 分类号：Q3 关键词：纤毛虫 游仆虫 融合表达 转录起始位点 加多聚腺苷酸位点鱼腥藻Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达
随着更多蓝藻全基因组序列测定完成,蓝藻基因工程研究现已进入后基因组时代.Kaneko等完成了鱼腥藻7120全基因组序列测定,随后人们利用生物信息学的方法对其中一些基因的功能进行了预测,包括Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FBA)基因,但该基因是否编码Ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶及该产物的'相关酶学特性至今尚未见报道.通过PCR克隆到鱼腥藻7120中预测的Ⅱ型FBA基因,插入到质粒pET-32a的相应位点,构建成原核表达载体pET-FBA-Ⅱ.蛋白电泳结果显示,重组蛋白的表达量占总蛋白含量的23.4%,与蛋白分子标记相比,其分子量约为40 kDa.酶学活性测定结果表明,其蛋白粗提物的比活力为11.8 U(mg protein)-1,具有标准Ⅱ型FBA活性.证实了Cyanobase中关于该基因功能的预测,也为进一步研究该基因表达产物的生理生化特性及功能提供了重要资料.
作 者：魏兰珍 崔轶文 马为民 王全喜 WEI Lan-zhen CUI Yi-wen MA Wei-min WANG Quan-xi 作者单位：上海师范大学生命与环境科学学院,上海,34 刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 26(5) 分类号：Q78 关键词：果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 鱼腥藻7120 表达 酶活qa-3稀有密码子和mRNA结构改造及其在大肠杆菌中的高效表达
奎尼酸脱氢酶的高表达是奎尼酸生物合成的代谢工程研究的的基因qa-3在大肠杆菌中不表达,根据大肠杆菌密码子使用频率分析qa-3基因,发现有27个稀有密码子,其中编码Arg(R)的有8个,编码Gly(G)的有9个.编码精氨酸的AGG(AGA)两个稀有密码子紧密相连(R区),另外还有个相对比较集中的GGG密集区G区.进一步通过计算机分析其qa-3基因mRNA二级结构,发现改变5′和3′末端个别碱基对其二级结构的影响很大,可以使mRNA的自由能由野生型的-374.3 kJ/mol降低到最小-80.5 kJ/mol,从而大大减少mRNA两端二级结构的`产生,而仅仅改变R区和G区的稀有密码子自由能变化很小.通过对该基因密码子改造和优化5′和3′末端对其mRNA二级结构的影响,在大肠杆菌中表达真菌的基因qa-3,并测到了奎尼酸脱氢酶活性,为构建产奎尼酸工程菌株奠定基础.
作 者：刘礼兵 刘云 何华庆 李永辉 徐琪寿 LIU Li-Bing LIU Yun HE Hua-Qing LI Yong-Hui XU Qi-Shou 作者单位： 刊 名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(2) 分类号：Q786 关键词：qa-3 密码子 mRNA二级结构 奎尼酸脱氢酶