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基因重组BDNF蛋白在大肠杆菌中的表达纯化与功能鉴定
目的 构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,以获取高产量、低成本、高纯度且具有生物学活性的BDNF蛋白.方法 以人的全长BDNFcDNA为模板,用PCR方法扩增成熟区BDNF的cDNA,应用基因重组技术将人BDNF cDNA克隆到质粒pET-30a(+)中,进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定.将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS,经IPTG诱导表达后,用Ni-NTA亲和层析纯化获取蛋白,用SDS-PAGE和western blot方法鉴另,噻唑蓝(MTT)法检测重组蛋白对PC12细胞增殖的.影响. 结果 扩增出的人BDNF cDNA片段克隆进了原核表达载体,经酶切和核酸测序鉴定,得到了正确的重组质粒pET-BDNF,并在大肠杆菌中获得了表达.纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带;用抗BDNF的抗体进行western blot分析证明目的蛋白获得了表达.基因重组BDNF蛋白能够促进PC12细胞增殖.结论 本研究成功构建了表达基因重组人BDNF的原核表达载体,基因重组人BDNF蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化,所获得的基因重组蛋白具有较好的生物学活性.
作 者：马蕾蕾 苏丹 季爱民 MA Lei-lei SU Dan JI Ai-min 作者单位：510282,广州,南方医科大学珠江医院新药研发中心 刊 名：中华神经医学杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF NEUROMEDICINE 年，卷(期)： 5(11) 分类号：Q5 关键词：脑源性神经营养因子 大肠杆菌 蛋白表达 蛋白纯化 生物学活性牛SRY蛋白表达纯化与体外功能鉴定
利用PCR技术从北京黑白花奶牛(Bos taurus)的基因组DNA中克隆了SRY(Sex-determining region on the Y chromosome)基因编码区全长序列.序列分析表明牛SRY基因的HMG区(High mobility group)呈现高度的保守性,与人、小鼠、猪等的相似性达到70%.将SRY基因与pET-28a(+)载体相连,构建表达载体pET-28a/SRY;把该表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导30℃诱导4 h,SRY蛋白可高效表达,表达产物占总蛋白量的26%.对表达产物进行了Western-blotting检测,并采用亲和层析技术获得了高纯度的`牛SRY蛋白.通过PCR技术分别获得牛、人、鼠的苗勒氏管抑制物(Mullerian Inhibiting substances,MIS)启动子,凝胶阻滞试验证明,牛SRY蛋白可与人及牛的MIS启动子结合,但与鼠的Mis启动子不发生相互作用[动物学报52(6):1082-1087,2006].
作 者：裴杰 杜卫华 刘小林 柳向军 朱化彬 赵金红 林秀坤 PEI Jie DU Wei-Hua LIU Xiao-Lin LIU Xiang-Jun ZHU Hua-Bin ZHAO Jin-Hong LIN Xiu-Kun 作者单位：裴杰,刘小林,柳向军,PEI Jie,LIU Xiao-Lin,LIU Xiang-Jun(西北农林科技大学动物科技学院,陕西,杨凌,712100)杜卫华,朱化彬,林秀坤,DU Wei-Hua,ZHU Hua-Bin,LIN Xiu-Kun(中国农业科学院畜牧研究所,北京,100094)
赵金红,ZHAO Jin-Hong(内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特,010018)
刊 名：动物学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA ZOOLOGICA SINICA 年，卷(期)：2006 52(6) 分类号：Q95 关键词：SRY基因 表达纯化 奶牛 Mis启动子重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展
长期以来,大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统,重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性,在细胞周质腔不仅能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠,还能促进分泌蛋白的N-端加工.本文综述了近年来在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白的`进展,目的是为了提高外源蛋白的生物活性.
作 者：郑海洲 刘晓志 宋欣 Zheng Haizhou Liu Xiaozhi Song Xin 作者单位：华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄,050015 刊 名：天津药学 英文刊名：TIANJIN PHARMACY 年，卷(期)： 21(4) 分类号：Q591.2 关键词：大肠杆菌 分泌表达 重组蛋白BDNF基因重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-BDNF的构建与鉴定
目的.构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组逆转录病毒表达载体.方法根据BDNF基因已知序列,设计合成一对引物并导入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点;从大鼠海马组织提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得编码BDNF的基因片段,与克隆载体pMD 18-T Simple连接构建pMDT-BDNF质粒;经HindⅢ、BamH Ⅰ双酶切,获得BDNF基因片断再克隆至逆转录病毒载体pLEGFP-N1中构建重组质粒pLEGFP-BDNF.结果限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子,测序结果证实与已知序列吻合. 结论构建的重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-BDNF含有序列正确的大鼠BDNF基因,可以作为今后治疗老年性痴呆动物模型转基因实验的基因来源.
作 者：李佳楣 龙大宏 冷水龙 罗秀梅 黄文燕 宣爱国 LI Jia-mei LONG Da-hong LENG Shui-long LUO Xiu-mei HUANG Wen-yan XUAN Ai-guo 作者单位：510182,广州,广州医学院人体解剖学教研室 刊 名：中华神经医学杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF NEUROMEDICINE 年，卷(期)： 5(5) 分类号：Q34 关键词：脑源性神经营养因子 逆转录病毒载体 基因重组猴D型逆转录病毒P27基因的表达、纯化及重组蛋白的鉴定
根据GenBank上已发表的.猴D型逆转录病毒SRV-2株基因组序列设计合成了一对特异性引物,通过PCR扩增出P27基因.将扩增出的片段克隆到原核表达载体pBAD/Thio-TOPO上,通过序列分析证实该片段与猴D型逆转录病毒SRV-2株P27基因序列一致,将阳性重组质粒转化至大肠杆菌TOPO10中,用阿拉伯糖诱导表达,表达的融合蛋白进行SDS-PAGE和WesternBlot分析,并用proBondTM柱在天然状态下进行纯化.结果表明,表达的融合蛋白分子量约为50KDa,其大小与预期相符.
作 者：程昀静 张利仙 段纲 艾军 龙云凤 董俊 严树发 周晓黎 CHENG Yun-Jing ZHANG Li-Xian DUAN Gang AI Jun LONG Yun-Feng DONG Jun YAN Shu-Fa ZHOU Xiao-Li 作者单位：程昀静,段纲,CHENG Yun-Jing,DUAN Gang(云南农业大学,动物科学技术学院,云南昆明,650201)张利仙,龙云凤,ZHANG Li-Xian,LONG Yun-Feng(昆明理工大学,云南昆明,650224)
艾军,董俊,严树发,周晓黎,AI Jun,DONG Jun,YAN Shu-Fa,ZHOU Xiao-Li(云南出入境检验检疫局,云南昆明,650228)
刊 名：中国动物检疫 PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ANIMAL HEALTH INSPECTION 年，卷(期)： “”(5) 分类号：S852.659.3 关键词：猴D型逆转录病毒 P27基因 表达 纯化牛分支杆菌MPT83基因的表达及重组蛋白的纯化
从牛分支杆菌培养物中抽提总DNA,扩增了MPT83基因,并克隆入pMD 18-T SimpleVector,将测序正确的目的基因插入表达载体pET-32a(+)中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,用亲和层析方法对表达蛋白进行了纯化.经测序,构建的`克隆质粒pMD-MPT83与GenBank中的序列一致;构建的表达质粒pET-MPT83经PCR和BamH Ⅰ+HindⅢ双酶切鉴定构建正确;经SDS-PAGE分析,在约42 ku处出现新的蛋白条带,4 h后表达量即达到高峰;Westernblotting分析表明,融合蛋白能够被牛分支杆菌阳性血清所识别;纯化的表达蛋白经SDS-PAGE电泳,出现清晰的单一条带.表明MPT83基因原核表达载体构建成功.
作 者：鲁俊鹏 罗满林 宋延华 邹潍力 LU Jun-peng LUO Man-lin SONG Yan-hua ZOU Wei-li 作者单位：鲁俊鹏,罗满林,邹潍力,LU Jun-peng,LUO Man-lin,ZOU Wei-li(华南农业大学,兽医学院,广东,广州,510642)宋延华,SONG Yan-hua(广东温氏食品集团有限公司,广东,新兴,527439)
刊 名：中国兽医科学 ISTIC PKU英文刊名：VETERINARY SCIENCE IN CHINA 年，卷(期)： 36(5) 分类号：S852.618 Q786 关键词：牛分支杆菌 MPT83基因 克隆 原核表达 蛋白纯化人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化
将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中,经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株.该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白,表达量占菌体总蛋白的'23%.包涵体经洗涤和溶解,在变性条件下利用Ni2+螯合柱纯化、尿素梯度复性后,得到纯度达98%以上的纯化蛋白.SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 000,Western-blot分析表明,在相应分子量处有一特异性条带,说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.
作 者：李桂英 邹德生 周立宏 曹玉华 LI Gui-ying ZOU De-sheng ZHOU Li-hong CAO Yu-hua 作者单位：吉林大学,分子酶学工程教育部重点实验室,长春,130021 刊 名：吉林大学学报（理学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF JILIN UNIVERSITY(SCIENCE EDITION) 年，卷(期)：2006 44(5) 分类号：Q786 关键词：人细胞周期蛋白D1 表达 包涵体 融合蛋白 蛋白质纯化 大肠杆菌Jo-1蛋白在大肠杆菌中的克隆与表达
构建在E.coli中表达人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)的质粒.用RT-PCR从人胎盘组织总RNA中获得编码人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)基因的全序列,将此片段定向克隆到麦芽糖融合蛋白表达载体pMAL-c中,诱导表达获得Jo-1的可溶性融合蛋白,并通过亲和层析予以纯化.结果免疫印迹实验表明,表达的融合蛋白能与含有抗Jo-1抗体的.病人血清发生特异反应,重组融合蛋白具有Jo-1蛋白的免疫原性和免疫特异性.
作 者：辛海涛 赵晓瑜 刘国振 王卫宁 侯颖娜 张峰 XIN Hai-tao ZHAO Xiao-yu LIU Guo-zhen WANG Weining HOU Ying-na ZHANG Feng 作者单位：辛海涛,赵晓瑜,侯颖娜,张峰,XIN Hai-tao,ZHAO Xiao-yu,HOU Ying-na,ZHANG Feng(河北大学,生命科学学院,河北,保定,071002)刘国振,LIU Guo-zhen(中科院基因组研究所,北京,100009)
王卫宁,WANG Weining(保定市建设医院,河北,保定,071000)
刊 名：河北农业大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF AGRICULTURAL UNIVERSITY OF HEBEI 年，卷(期)： 29(5) 分类号：Q81 关键词：人组氨酰-tRNA合成酶 PCR 克隆 表达 自身抗原GST-AEP融合蛋白的表达、纯化和鉴定
目的 利用GST融合基因表达系统表达GST-AEP融合蛋白,并进行纯化及鉴定.方法 IPTG诱导重组质粒pGEX-4T-1/AEP在大肠杆菌B121(DE3)中表达,溶菌酶裂解后,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行12%SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果 大肠杆菌经诱导,高效表达出相对分子质量约34 000的蛋白,与GST-AEP融合蛋白相符.Western blot结果显示该蛋白能够被兔抗GST多克隆抗体识别.结论 已成功表达并纯化了融合蛋白,为更深入研究AEP的`结构和功能奠定了基础.
作 者：高碧峰 王宗仁 卓鹏展 张德安 肖茜 作者单位：高碧峰,王宗仁,张德安,肖茜(第四军医大学附属西京医院中医科,西安,710032)卓鹏展(西安铁路医院内一科,西安,710004)
刊 名：中国生物制品学杂志 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS 年，卷(期)：2007 20(7) 分类号：Q786 关键词：抗癫痫肽 谷胱甘肽 融合蛋白 表达 纯化★ sTNFR Ⅱ和VIP融合蛋白的基因克隆表达、纯化及活性检测
