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鹅源新城疫病毒F和HN基因的表达及功能鉴定
鹅源新城疫病毒的F和HN基因经RT-PCR方法从尿囊液中扩增后分别克隆进pCR2.1载体,再分别亚克隆到真核表达载体pCI-neo上,构建了F基因的表达载体(pCI-F)和HN基因的表达载体(pCI-HN).间接免疫荧光(IFA)鉴定结果表明:F和HN基因均能在细胞中得到较好的表达;将pCI-F和pCI-HN共转染CEF和COS细胞,转染的细胞中能形成明显的合胞体.而用pCI-F单独进行转染时,不能产生合胞体,说明F蛋白要发挥其融合作用必须要有HN蛋白的`参与,同时也进一步证明F和HN蛋白与病毒的融合特性密切相关.
作 者：胡顺林 张艳梅 孙庆 吴艳涛 刘玉良 刘秀梵 HU Shun-lin ZHANG Hai-mei SHUN Qing WU Yan-tao LIU Yu-liang LIU Xiu-fan 作者单位：扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009 刊 名：扬州大学学报（农业与生命科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF YANGZHOU UNIVERSITY(AGRICULTURAL AND LIFE SCIENCE EDITION) 年，卷(期)： 27(4) 分类号：Q786 S852.65+9.5 关键词：鹅 新城疫病毒 F蛋白 表达 合胞体新城疫病毒F和HN蛋白的原核表达
目的:高水平表达新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)标准强毒F48E8株的.F基因和HN基因.方法:利用PCR方法扩增出新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV)标准强毒F48E8株的去掉N端信号肽和C端跨膜区的F基因和HN基因并将其克隆到原核表达载pET30a上,得到重组质粒rpET30a-NDV/F和rpET30a-NDV/HN,转化到受体菌Rosetta-gamiTM2感受态细胞中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot检测.结果:表达的F蛋白大小约为40kD,HN蛋白大小约为51kD左右,符合预期结果.Western blot分析表明,能与抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应.结论:重组蛋白在原核表达系统内得到了高水平的表达.说明了去除F和HN基因N端信号肽和C端跨膜区的必要性.
作 者：冉旭华 闻晓波 赵喜红 刘长凤 RAN Xu-hua WEN Xiao-bo ZHAO Xi-hong LIU Chang-feng 作者单位：黑龙江八一农垦大学动物科技学院,黑龙江大庆,163319 刊 名：生物技术 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 18(3) 分类号：Q786 关键词：新城疫病毒(NDV) F蛋白 HN蛋白 原核表达表达鸡新城疫病毒F、HN基因和传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒的构建及其特性研究
利用同源重组将新城疫病毒(NDV)的F和HN基因、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因以及报告基因LacZ插入鸡痘病毒(FPV)的017株的复制非必需区,其中NDV的F、HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ是在早晚期启动子LP2EP2的控制下,大肠杆菌报告基因LacZ在晚期启动子P11的控制下.经过10轮蓝斑纯化获得了包含了NDV的F和HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ的重组鸡痘病毒,称为rFPV-F/HN/gB/LacZ.经PCR方法证明rFPV-F/HN/gB/LacZ基因组中含有NDV的F基因、HN基因和ILTVgB基因;间接免疫荧光试验和 Western-blot试验表明NDV的F、HN蛋白和ILTV gB蛋白在rFPV-F/HN/gB/LacZ 感染的'CEF细胞中获得表达.与亲本毒相比,重组病毒在病毒的复制和致鸡胚成纤维细胞的病变方面无显著不同.这证明了在鸡痘病毒载体的一个复制非必需区可以同时插入多个禽类病原的多个外源基因,为制备多价基因工程疫苗奠定了基础.
作 者：孙惠玲 王云峰 苗得园 张培君 智海东 徐灵龙 王玫 童光志 汪明 SUN Hui-Ling WANG Yun-Feng MIAO De-Yuan ZHANG Pei-Jun ZHI Hai-Dong XU Ling-Long WANG Mei TONG Guang-Zhi WANG Ming 作者单位：孙惠玲,SUN Hui-Ling(中国农业大学动物医学院,北京,100094;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001;北京市农业科学院畜牧兽医研究所,北京,100094)王云峰,智海东,徐灵龙,王玫,WANG Yun-Feng,ZHI Hai-Dong,XU Ling-Long,WANG Mei(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001)
苗得园,张培君,MIAO De-Yuan,ZHANG Pei-Jun(北京市农业科学院畜牧兽医研究所,北京,100094)
童光志,TONG Guang-Zhi(中国农业大学动物医学院,北京,100094;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨,150001)
汪明,WANG Ming(中国农业大学动物医学院,北京,100094)
刊 名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 22(6) 分类号：Q78 关键词：重组鸡痘病毒 新城疫病毒 传染性喉气管炎病毒 F基因 HN基因 gB基因新城疫病毒HN基因的遗传变异与HI相关性的研究
选取国内～分离的新城疫野毒10株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,对其血凝素-神经氨酸酶(HN)基因分别进行克隆和测序,结合在GenBank中发表的LaSota、F48E9和Clone30等参考序列,对其氨基酸序列进行遗传变异分析,绘制系统发育树.利用SPF鸡在隔离器中分别制备上述NDV毒株的`单因子阳性血清,进行血凝抑制(HI)交叉试验,计算NDV不同株之间的HI相关系数(r).利用统计学软件SPSS8.0对NDV不同株之间的HN氨基酸同源率和HI相关系数(r)进行相关比较.结果表明:NDV野毒间氨基酸高度同源,同源性为96.5%～99.8%,而与LaSota、F48E9和Clone30同源率仅为87.4%～89.9%;所有野毒均缺乏1个潜在的糖基化位点;HN基因的氨基酸同源性与HI相关系数显著相关(P<0.01,r=0.55).
作 者：秦卓明 王友令 马保臣 欧阳文军 贾强 袁小远 崔治中 QIN Zhuo-ming WANG You-ling MA Bao-chen OUYANG Wen-jun JIA Qiang YUAN Xiao-yuan CUI Zhi-zhong 作者单位：秦卓明,QIN Zhuo-ming(山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271018;山东农业科学院,家禽研究所,山东,济南,250100)王友令,欧阳文军,贾强,袁小远,WANG You-ling,OUYANG Wen-jun,JIA Qiang,YUAN Xiao-yuan(山东农业科学院,家禽研究所,山东,济南,250100)
马保臣,崔治中,MA Bao-chen,CUI Zhi-zhong(山东农业大学,动物科技学院,山东,泰安,271018)
刊 名：病毒学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY 年，卷(期)：2006 22(5) 分类号：S858.31 关键词：新城疫病毒 HN 基因 氨基酸同源性 HI 相关性新城疫病毒HN基因诱导人肺癌细胞SPC-A1凋亡的作用机制
为了探索新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(HN)基因对人肺癌细胞SPC-A1的`作用及机制,将含有HN基因的重组质粒pVHN经脂质体介导转染人肺癌细胞SPC-A1,通过MTT方法检测细胞活力;采用吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色分析肿瘤细胞凋亡;罗丹明123和DCFA染色测定线粒体跨膜电位(△ψm)和活性氧水平变化;流式细胞仪分析MHC-Ⅰ分子表达;底物染色反应检测caspase-3活性.结果重组质粒pVHN转染人肺癌细胞SPC-A1 48 h后,细胞活力明显降低;AO/EB染色可见明显的细胞凋亡形态学变化;与空质粒对照相比,线粒体△ψm下降(P＜0.01),活性氧水平升高(P＜0.05);细胞表面MHC-I分子表达上调(P＞0.05);caspase-3活性增强(P＜0.01).以上结果提示,新城疫病毒HN基因能够上调SPC-A1细胞表面MHC-Ⅰ分子表达,并通过上调ROS水平,下调线粒体△ψm,进而激活caspase-3,最终诱导人肺癌细胞凋亡.
作 者：连海 金宁一 李霄 陈立刚 张静敏 管国芳 孙丽丽 李雪梅 郑洪玲 崔英姬 LIAN Hai JIN Ning-Yi LI Xiao CHEN Li-Gang ZHANG Jing-Min GUAN Guo-Fang SUN Li-Li LI Xue-Mei ZHENG Hong-Ling CUI Ying-Ji 作者单位：连海,LIAN Hai(解放军军事医学科学院解放军基因工程重点实验室,长春,130062;吉林大学农学部畜牧兽医学院,长春,130062)金宁一,李霄,陈立刚,张静敏,管国芳,孙丽丽,李雪梅,郑洪玲,JIN Ning-Yi,LI Xiao,CHEN Li-Gang,ZHANG Jing-Min,GUAN Guo-Fang,SUN Li-Li,LI Xue-Mei,ZHENG Hong-Ling(解放军军事医学科学院解放军基因工程重点实验室,长春,130062)
崔英姬,CUI Ying-Ji(吉林大学农学部图书馆,长春,130062)
刊 名：中国生物化学与分子生物学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY 年，卷(期)： 22(3) 分类号：Q255 Q75 关键词：新城疫病毒 HN基因 人肺癌细胞 凋亡表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组病毒免疫及强毒攻击后外周血T淋巴细胞亚群的动态
采用流式细胞检测技术对表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒(rFPV-gB-F)、新城疫弱毒疫苗以及传染性喉气管炎弱毒疫苗免疫和传染性喉气管炎以及新城疫强毒攻击后外周血T细胞表型亚类(CD4+、CD8+、TCRγδ+)的.变化动态进行监测.重组疫苗和禽痘疫苗免疫之后,CD8+和TCRγδ+的细胞数先升高后回落;在NDV强毒攻击之后,ND疫苗免疫组的TCRγδ+数量升高,rFPV-gB-F免疫组的三种细胞数量在第1周都下降,随后升高;ILT疫苗在免疫后的第1周,CD4+细胞数量下降.结果提示rFPV-gB-F可以诱发相应的细胞免疫应答,但是有关传染性喉气管炎病毒导致的细胞免疫需要进一步的研究.
作 者：智海东 王云峰 孙永科 张晶 王玫 彭金美 刘永刚 童光志 ZHI Hai-dong WANG Yun-feng SUN Yong-ke ZHANG Jing WANG Mei PENG Jin-mei LIU Yong-gang TONG Guang-zhi 作者单位：智海东,王云峰,张晶,王玫,彭金美,刘永刚,童光志,ZHI Hai-dong,WANG Yun-feng,ZHANG Jing,WANG Mei,PENG Jin-mei,LIU Yong-gang,TONG Guang-zhi(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001)孙永科,SUN Yong-ke(西北农林科技大学,动物医学系,陕西,杨凌,712100)
刊 名：中国预防兽医学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF PREVENTIVE VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2006 28(5) 分类号：Q784 S852.65 关键词：传染性喉气管炎 新城疫 重组禽痘病毒 外周血T淋巴细胞3株鹅源新城疫病毒的分子特征和遗传发生分析
分离的3株鹅源新城疫病毒毒株经毒力(MDT)检测为强毒株,鸡胚平均死亡时间为48～60 h.RT-PCR扩增出了融合蛋白(F)基因,测定相应的核苷酸序列并进行遗传发生分析和酶切位点分析.对基因编码的'氨基酸序列进行了推导,3个试验毒株的蛋白酶裂解激活位点附近的氨基酸序列均为112R(K)RQKR↓F117,为强毒特征序列.根据绘制的系统进化发生树和F基因上3种限制性内切酶(RE)位点分布,确定了这3个毒株均为基因Ⅶ型.以上证据表明该基因型的新城疫病毒在我国鹅群的流行占据一定优势.
作 者：焦库华 马晓丹 马建云 刘文博 JIAO Ku-hua MA Xiao-dan MA Jian-yun LIU Wen-bo 作者单位：扬州大学,兽医学院,江苏,扬州,225009 刊 名：中国兽医学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF VETERINARY SCIENCE 年，卷(期)： 26(6) 分类号：S852.65 关键词：鹅 新城疫病毒 遗传发生树鸡新城疫病毒HeB02分离株F基因的克隆及其DNA疫苗的研究
根据GenBank报道的鸡新城疫病毒F基因序列设计了一对引物,以鸡新城疫病毒HeB02分离株基因组为模板,通过RT-PCR扩增出了1.66kb左右的F基因片段,序列分析表明HeB02株F基因与国内标准强毒株F48 E9及弱毒疫苗La Sota和Clone30的F基因核苷酸序列的同源性分别为88.1%、84.9%和83.8%.将HeB02株F基因插入真核表达载体pVAX1中,构建了真核表达质粒pSV-F,通过脂质体转染COS-7细胞,SDS-PAGE分析可见表达的特异蛋白条带;Western blot、ELISA和中和试验检测结果表明:真核表达的.蛋白与抗新城疫病毒的抗体发生特异性反应,说明F蛋白具有很好的免疫原性.采用活体电击法以真核表达质粒pSV-F免疫3周龄SPF鸡,剂量为50μg/只,3周后加强免疫1次,5周后以100倍鸡胚感染剂量(EID)的F基因同源病毒对所有鸡进行攻毒,攻毒前后每周分别以喉拭子进行病毒分离和HI效价测定.结果显示对照组在攻毒前一直没有检测到抗体效价,攻毒后检测效价为3.0 log2±1.40,并且于攻毒后第9天全部死亡;活疫苗组和实验组免疫后第2周检测到抗体效价,第5周最高,HI效价分别为8.3 1og2±1.30和7.2log2±1.23,攻毒1周后HI效价分别达9.8log2±1.55和8.9log2±1.77,极显著高于对照组(P＜0.01).免疫组未分离到新城疫病毒,对照组全部分离到新城疫病毒.表明所构建的F基因真核表达质粒可作为候选基因疫苗诱导鸡产生免疫保护反应.
作 者：李楠 孙一敏 赵宝华 LI Nan SUN Yi-Min ZHAO Bao-Hua 作者单位：河北师范大学生命科学学院,石家庄,050016 刊 名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(3) 分类号：Q785 关键词：新城疫病毒 F基因 克隆和表达 DNA疫苗