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sTNFR Ⅱ和VIP融合蛋白的基因克隆表达、纯化及活性检测
可溶性肿瘤坏死因子受体Ⅱ(sTNFRⅡ)和血管活性肠肽(VIP)对类风湿性关节炎(RA)均有治疗作用,但两者的作用机制不同.制备两者融合蛋白,可能具有更好的防治类风湿关节炎的`作用.用含有VIP基因序列的上游引物和sTNFRⅡ的下游引物,用PCR扩增出由连接序列将VIP和sTNFRⅡ基因连接的片段,再亚克隆到原核表达载体pET32a,在大肠杆菌DH5α内诱导表达.表达的产物经离子交换、疏水层析纯化,并用体外中和试验检测其抑制TNF细胞毒及肝细胞膜特异性脂蛋白(Lsp)诱导的细胞毒生物活性.结果显示构建的pET32a-VIP-sTNFRⅡ表达载体在大肠杆菌DH5α内以包涵体形式表达,疏水层析结合离子交换层析纯化后,融合蛋白具有较好的抑制炎症分子诱导的炎症反应生物活性,为将来应用打下基础.
作 者：王虹 曾位森 陈金华 王珊珊 刘丹 杨艳妮 陈百宏 李玲 WANG Hong ZENG Wei-sen CHEN Jin-hua WANG Shan-shan LIU Dan YANG Yan-ni CHEN Bai-hong Li Ling 作者单位：广州蓝星生物科技开发有限公司,广州,510663 刊 名：中国生物工程杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)： 26(5) 分类号：Q78 关键词：sTNFRⅡ VIP 融合蛋白 表达 纯化重组人PD-1IgV融合蛋白的克隆、表达、纯化及生物学活性检测
目的:获得具有生物学活性的'重组人PD-1IgV(rhPD-1IgV)蛋白.方法:人工合成PD-1IgV基因,并将该基因克隆入原核表达载体pQE-30中.转化宿主细胞大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导表达重组融合rhPD-1IgV蛋白.对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测分析.结果:rhPD-1IgV的Mr约为15×103,与根据其氨基酸组成计算的理论值一致.成功纯化了rhPD-1IgV蛋白,并对其进行了复性和浓缩,且复性后的蛋白可与其配体B7-H1结合,显示出良好的结合活性.结论:成功地克隆、表达和纯化了rhPD-1IgV蛋白.
作 者：王伟华 张英起 颜真 WANG Wei-Hua ZHANG Ying-Qi YAN Zhen 作者单位：第四军医大学药学系生物技术中心,陕西,西安,710033 刊 名：第四军医大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF THE FOURTH MILITARY MEDICAL UNIVERSITY 年，卷(期)：2006 27(5) 分类号：Q78 关键词：PD-1IgV 重组融合蛋白 纯化 复性 pQE-30载体人α防御素融合表达、纯化及生物活性检测
目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料.方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4- HDα.测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达.经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性.结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%.抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的`抑制作用.结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础.
作 者：傅海燕 张剑 路凡 蒲勤 王孝功 卢兹凡 徐俊卿 赵忠良 FU Hai-yan ZHANG Jian LU Fan PU Qin WANG Xiao-gong LU Zi-fan XU Jun-qing ZHAO Zhong-liang 作者单位：傅海燕,张剑,路凡,蒲勤,王孝功,卢兹凡,赵忠良,FU Hai-yan,ZHANG Jian,LU Fan,PU Qin,WANG Xiao-gong,LU Zi-fan,ZHAO Zhong-liang(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西,西安,710032)徐俊卿,XU Jun-qing(第四军医大学西京医院放射科,陕西,西安,710032)
刊 名：细胞与分子免疫学杂志 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY 年，卷(期)： 22(2) 分类号：Q786 关键词：人α防御素(HDα) 表达 纯化 生物学活性 检测表达双功能融合蛋白(sCAR-EGF)腺病毒载体的构建及其活性检测
为了提高腺病毒载体用于基因治疗的靶向性,采用PCR和体外连接的方法构建了柯萨奇病毒-腺病毒受体(Coxsackie virus-Adenovirus Receptor)胞外段sCAR和表皮生长因子(Epidermal growth factor)EGF融合基因,然后将此融合基因插入穿梭质粒pDC315.利用Ad-MAX腺病毒系统,将重组质粒pDC315-sCAR-EGF与腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE13cre共同转染AD-293细胞,成功包装出一种复制缺陷型腺病毒Ad5-CMV-sCAR-EGF.经PCR鉴定该病毒含有sCAR-EGF融合基因片段,Western blotting证实该病毒能表达sCAR-EGF融合蛋白.体外试验证实该病毒感染细胞所产生的融合蛋白能够引导携带报告基因的腺病毒Ad5-CMV-luc高水平感染肿瘤细胞,为高水平表达EGFR的肿瘤的.靶向性基因治疗提供了新的手段.
作 者：任鹏康 王丰 李惠明 李宗海 黄倩 REN Peng-Kang WANG Feng LI Hui-Ming LI Zong-Hai HUANG Qian 作者单位：任鹏康,REN Peng-Kang(上海市第一人民医院中心实验室,上海,80)王丰,李惠明,黄倩,WANG Feng,LI Hui-Ming,HUANG Qian(上海交通大学附属第一人民医院中心实验室,上海,200080)
李宗海,LI Zong-Hai(上海交通大学肿瘤研究所癌基因及相关基因研究国家重点实验室,上海,200032)
刊 名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(5) 分类号：Q81 关键词：腺病毒 表皮生长因子受体 基因治疗 柯萨奇病毒-腺病毒受体IL15/PAP融合蛋白基因克隆及其原核与植物表达载体的构建
将IL15和PAP基因通过一甘氨酸接头(Gly4Ser)3连接在一起,构建原核和植物表达载体,以期表达具有导向杀伤活性的融合蛋白.在引物设计中,通过引物在IL15基因下游引入(Gly4Ser)3的'编码序列和Bam HI位点,然后采取分步克隆及PCR、酶切、连接等一系列分子克隆方法,将IL15和PAP基因融合在一起,构建融合蛋白的原核与植物表达载体.经PCR和Nco Ⅰ/SalⅠ双酶切鉴定及测序,证实原核表达载体pET32a-IL15/PAP及植物表达载体pB-I P中均插入了正确的融合基因序列.
作 者： 作者单位： 刊 名：河南农业大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF HENAN AGRICULTURAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 40(3) 分类号：Q813.2 关键词：IL15/PAP融合蛋白 表达载体 构建人源胸腺素α原和白介素2融合蛋白的基因克隆与原核表达
目的 克隆人胸腺素α原/白介素2 融合基因,构建其原核表达载体并在大肠杆菌系统中有效表达.方法 采用RT-PCR方法,从人白血病细胞和人T淋巴细胞中分别扩增得到胸腺素α原/白介素2 基因,利用基因重组技术将融合基因片段重组于pET42a原核表达载体上,构建成pET42a-PI.经酶切、测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,IPTG诱导蛋白表达.表达产物经离子交换和分子筛纯化后进行Western blot分析,通过人外周血单核细胞玫瑰花结实验对融合蛋白进行了初步的活性测定.结果 凝胶电泳显示PCR产物的长度约750 bp,测序结果表明,扩增片段与预期序列一致.重组菌在IPTG诱导下表达相对分子质量为28 kDa的'蛋白,纯化后的融合蛋白能提高人外周血单核细胞玫瑰花结形成率,表明具有一定活性.结论 成功克隆和构建了人胸腺素α原/白介素2融合基因的原核表达载体,并在原核表达系统中得到有效表达.
作 者：黄明 韦剑 周飞燕 HUANG Ming WEI Jian ZHOU Fei-yan 作者单位：广州拜迪生物医药有限公司,广东,广州,511495 刊 名：广东药学院学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF GUANGDONG COLLEGE OF PHARMACY 年，卷(期)：2008 24(3) 分类号：Q786 关键词：胸腺素α原 白介素2 融合蛋白 表达