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Stxl-A亚单位的原核表达、复性及抗原性鉴定
目的 构建志贺毒素1-A亚单位(Stxl-A)原核表达质粒,使其在大肠埃希菌中表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其抗原性及应用价值.方法 以大肠埃希菌0157 DNA为模板扩增Stxl-A基因,重组克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌B121(DE3),异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,包涵体经镍柱柱上复性和纯化,并对纯化产物进行Western印迹鉴定.结果 重组质粒经双酶协鉴定和测序分析后证实构建成功.重组蛋白经十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,其表达量占细菌总蛋白量的.15%左右,主要以包涵体形式存在,通过镍柱柱上复性获得纯化的可溶性Stxl-A蛋白,纯度达95%以上,Western印迹检测显示特异性条带.结论 成功构建了pET32a(+)/Stxl-A重组质粒,并获得了具有抗原特异性的可溶性Stxl-A蛋白,为进一步制备抗Stxl-A抗体和研究其生物学功能奠定了基础.
作 者：葛以跃 崔仑标 史智扬 焦永军 曾晓燕 戚宇华 唐震 单云峰 吴涛 汪华 GE Yiyue CUI Lunbiao SHI Zhiyang JIAO Yongjun ZENG Xiaoyan QI Yuhua TANG Zheng SHAN Yunfeng WU Tao WANG Hua 作者单位：江苏省疾病预防控制中心微生物检验科,南京市,210009 刊 名：医学分子生物学杂志 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MEDICAL MOLECULAR BIOLOGY 年，卷(期)： 5(4) 分类号：Q786 关键词：大肠埃希菌O157 志贺样毒素 质粒的构建与鉴定 原核表达重组甘蔗ACC氧化酶cDNA原核表达的纯化复性研究
重组甘蔗ACC氧化酶基因在大肠杆菌中表达,其产物以不溶性包涵体存在.用Ni2+-NTA亲和层析柱对其进行纯化,结果显示,在层析柱上直接复性及纯化的方法比在变性条件下Ni2+-NTA纯化然后稀释透析进行复性的方法简捷,效果好,获得的`目的蛋白质纯度大于98%,活性为132.58 nmol C2H4/(mg・h).
作 者：韦波 王爱勤 范业赓 韦宇拓 何龙飞 杨丽涛 李杨瑞 WEI Bo WANG Ai-qin FAN Ye-geng WEI Yu-tuo HE Long-fei YANG Li-tao Li Yang-rui 作者单位：韦波,范业赓,何龙飞,WEI Bo,FAN Ye-geng,HE Long-fei(广西大学,农学院,广西,南宁,530005)王爱勤,杨丽涛,WANG Ai-qin,YANG Li-tao(广西大学,农学院,广西,南宁,530005;广西大学,糖业工程技术研究中心甘蔗研究所,广西,南宁,530004)
韦宇拓,WEI Yu-tuo(广西大学,生命科学与技术学院,广西,南宁,530005)
李杨瑞,Li Yang-rui(广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,广西,南宁,530007)
刊 名：广西农业生物科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF GUANGXI AGRICULTURAL AND BIOLOGICAL SCIENCE 年，卷(期)： 25(3) 分类号：Q786 关键词：重组甘蔗ACC氧化酶 融合蛋白 包涵体 Ni2+-NTA 纯化 复性人载脂蛋白A-Ⅰ的原核表达及二级结构和功能鉴定
目的`为获得高产量并具有正常结构和生物学活性的原核表达人载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ).方法利用DNA重组技术对人apoA-Ⅰ的前8个氨基酸引入沉默突变,以pET-30b(+)为原核表达载体,在apoA-Ⅰ多肽链C-末端引入6×组氨酸标签,采用镍亲和层析对表达蛋白进行纯化.分别使用圆二色分析、浊度澄清试验和胆固醇外流试验对重组apoA-Ⅰ的α螺旋含量、脂质结合动力学及促细胞胆固醇外流能力进行评价.结果获得高表达产量的重组apoA-Ⅰ(12 mg纯化apoA-Ⅰ蛋白/L菌液);重组蛋白的α螺旋含量为(54±4)%,脂质结合动力学速率常数k1/2为0.059±0.002 min-1,胆固醇外流百分比为(16.68±1.77)%.结论可获得高产量并具有生物学活性的重组人apoA-Ⅰ;为构建apoA-Ⅰ其他突变体提供模式.
作 者：祝学卫 吴钢 曾武威 薛红 陈保生 ZHU Xue-wei WU Gang ZENG Wu-wei XUE Hong CHEN Bao-sheng 作者单位：中国医学科学院,中国协和医科大学,基础医学研究所,医学分子生物学国家重点实验室,北京,100005 刊 名：基础医学与临床 ISTIC PKU英文刊名：BASIC & CLINICAL MEDICINE 年，卷(期)：2006 26(4) 分类号：Q816 关键词：人载脂蛋白A-Ⅰ 原核表达 α螺旋含量 脂质结合 细胞胆固醇外流鸡痘病毒ORF073基因克隆及原核表达
根据已经发表的鸡痘病毒(FPV)美国致病株的ORF073基因序列,设计1对引物,分别以282E4FPV、LP株FPV、102E6FPV为模板,扩增出目的片段,将其克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定证实,并进行序列测定.目的片段包含了大小为522 bp的ORF073基因,与GenBank上的AF198100(FPVUS)和AJ581527(FP9)序列进行序列比较分析表明:3种病毒株的`ORF073基因与鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)和英国弱毒株(FP9)完全一致.克隆的ORF073基因与原核表达载体pET-28a构建重组表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)细菌中表达了分子质量约32 ku的蛋白.
作 者：王彦红 马怀良 胡顺林 仇旭升 刘秀梵 WANG Yan-hong MA Huai-liang HU Shun-ling QIU Xu-shen LIU Xiu-fan 作者单位：扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009 刊 名：扬州大学学报（农业与生命科学版） ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF YANGZHOU UNIVERSITY(AGRICULTURAL AND LIFE SCIENCE EDITION) 年，卷(期)： 27(4) 分类号：Q786 S852.65+9.1 关键词：鸡痘病毒 ORF073 基因克隆 原核表达GST-talin1融合蛋白的原核表达及纯化
应用PCR方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX-4T-1中,获取人源的'GST-talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础.经酶切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B柱纯化,western blot鉴定.克隆得到了一个2400bp的talin1的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为121.6kD的融合蛋白.用基因工程方法使GST-talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST-talin1融合蛋白.
作 者：吴爽 耿建国 WU Shuang GENG Jian-guo 作者单位：吴爽,WU Shuang(广东药学院基础学院组织胚胎教研室,广州,510006;中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海,31)耿建国,GENG Jian-guo(中科院生化细胞研究所分子细胞生物学实验室,上海,200031)
刊 名：生物学杂志 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF BIOLOGY 年，卷(期)： 25(3) 分类号：Q51 关键词：talin P-选凝素 GST-融合蛋白 亲和层析大肠杆菌glgC基因的克隆及原核表达
以大肠杆菌BL21染色体DNA为模板,根据glgC基因的全序列设计了1对引物,在优化的.PCR反应条件下扩增出了glgC基因片段,测序结果显示该片段大小为1 296 bp,编码432个氨基酸残基.将该基因克隆到原核表达载体pET-28a-c(+)中,重组载体pET-glgC转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到了与理论推算的glgC基因表达产物分子质量(约53 kD)相符的特异蛋白条带.
作 者：贾笑英 张金文 王蒂 JIA Xiao-ying ZHANG Jin-wen WANG Di 作者单位：贾笑英,JIA Xiao-ying(甘肃农业大学,农学院,兰州,730070)张金文,王蒂,ZHANG Jin-wen,WANG Di(甘肃农业大学,农学院,兰州,730070;甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室,兰州,730070)
刊 名：西北植物学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA BOTANICA BOREALI-OCCIDENTALIA SINICA 年，卷(期)： 26(4) 分类号：Q785 Q786 关键词：glgC基因 克隆 原核表达 载体构建人IP-10蛋白原核表达及其活性鉴定
目的 构建人His标记的γ干扰素诱导蛋白10 (interferon-γ-inducible protein 10, IP-10)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达、纯化,获得有活性的IP-10蛋白,为进一步研究其在炎症过程中的作用机制及寻找新的抗炎途径提供基础.方法 从人肺cDNA文库中PCR扩增无信号肽的`IP-10基因编码序列,构建重组载体pET-14b/IP-10;重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株;经异丙基γ-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导后,用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白,以THP-1细胞进行微室跨膜迁移(transwell)实验鉴定融合蛋白活性.结果 酶切、测序鉴定重组载体pET-14b/IP-10构建正确,并纯化得到高纯度的IP-10融合蛋白.而且该蛋白具有诱导单核细胞THP-1跨膜迁移活性.结论 成功构建了人IP-10融合蛋白表达载体,并纯化得到具有活性的IP-10融合蛋白,为进一步研究IP-10的功能提供了重要的实验材料.
作 者：邵紫韫 彭毅 SHAO Zi-yun PENG Yi 作者单位：邵紫韫,SHAO Zi-yun(广州军区武汉总医院医务部,武汉,430070)彭毅,PENG Yi(广州军区武汉总医院心血管内科)
刊 名：华南国防医学杂志 ISTIC英文刊名：MILITARY MEDICAL JOURNAL OF SOUTH CHINA 年，卷(期)： 22(4) 分类号：Q78 关键词：γ干扰素诱导蛋白10 融合蛋白 细胞迁移奥利亚罗非鱼促性腺激素释放激素cDNA的原核表达及其免疫原性研究
促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是下丘脑分泌产生的神经激素,对脊椎动物生殖的调控起重要作用.为研究GnRH对奥利亚罗非鱼性腺发育的作用,构建了GnRH cDNA的原核表达载体并进行融合表达.利用RT-PCR方法从丘脑中扩增出长约400bp的目的序列GnRH基因,克隆至T载体中,经酶切鉴定和序列测定分析确认序列的正确性后将此片段克隆到表达载体pMAL-c2x中构建重组表达质粒pMAL-GnRH,并在大肠杆菌TB1中获得了高表达,目的蛋白约占菌体总蛋白的41.6%.菌体经溶菌酶裂解,制备无细胞抽提液,Amylose-sepharose柱层析后得到分子量为56kD单一条带的.目的蛋白.目的蛋白经Factor Xa酶切裂解,Amylose-sepharose过柱纯化后得到纯化的GnRH前体蛋白.以80μg/只的剂量4次免疫ICR小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对GnRH前体蛋白的血清抗体应答,免疫组抗体水平显著高于空白组(P＜0.05),且加强免疫第5周后抗体效价为0.707±0.320,达到高峰值,说明表达产物具有免疫原性,可以刺激机体产生免疫应答.
作 者：丁炜东 曹丽萍 吴婷婷 DING Wei-Dong CAO Li-Ping WU Ting-Ting 作者单位：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,农业部水生动物遗传育种和养殖生物学重点开放实验室,无锡,214081 刊 名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 22(4) 分类号：Q786 关键词：奥利亚罗非鱼 促性腺激素释放激素 促性腺激素释放激素相关肽 原核表达 抗体 免疫原性